Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) in der Nanoforschung

Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist die Methode, mit der man Nanopartikel tatsächlich sieht: Ein Elektronenstrahl durchdringt eine sehr dünne Probe und erzeugt ein Bild mit einer Auflösung bis unter einen Nanometer. Damit lassen sich Größe, Form und Kristallstruktur einzelner Partikel bestimmen, und aus vielen ausgemessenen Partikeln entsteht eine anzahlbasierte Größenverteilung. Weil die Probe trocken im Vakuum liegt, ergänzt die TEM Messungen in Lösung, ersetzt sie aber nicht.

Dieser Artikel erklärt, wie ein TEM funktioniert, wie Proben vorbereitet werden, wann die Kryo-TEM nötig ist und wie Sie aus Bildern eine belastbare Größenverteilung gewinnen.

Wie ein Transmissionselektronenmikroskop funktioniert

Licht kann zwei Punkte nur dann getrennt abbilden, wenn ihr Abstand nicht viel kleiner als etwa die halbe Wellenlänge ist. Mit sichtbarem Licht liegt die Grenze deshalb bei rund 200 Nanometern, zu grob für die meisten Nanopartikel. Elektronen, die mit hoher Spannung beschleunigt werden, haben eine Wellenlänge im Pikometerbereich. Damit sind Auflösungen im Bereich einzelner Atomabstände möglich.

Ein TEM besteht im Kern aus:

• einer Elektronenquelle, die Elektronen mit typischen Beschleunigungsspannungen im Bereich von etwa 80 bis 300 Kilovolt aussendet,
• elektromagnetischen Linsen, die den Strahl bündeln und das Bild vergrößern,
• der Probe auf einem winzigen Trägernetz im Hochvakuum,
• einem Detektor, heute meist einer Digitalkamera.

Der Kontrast entsteht, weil Bereiche mit schweren Atomen oder größerer Dicke mehr Elektronen streuen und im Bild dunkler erscheinen. Metall- und Metalloxidpartikel wie Gold, Silber oder Eisenoxid sind deshalb gut sichtbar, organische Hüllen dagegen kaum.

Probenvorbereitung

Die Präparation entscheidet über die Qualität der Ergebnisse. Für Nanopartikel ist das Standardvorgehen einfach, aber fehleranfällig.

Trocknen auf dem Netzchen

Ein Tropfen der Dispersion wird auf ein Kupfernetzchen mit dünnem Kohlenstofffilm gegeben. Nach kurzer Zeit wird überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier abgezogen, der Rest trocknet. Beim Trocknen wandern Partikel mit der schrumpfenden Flüssigkeit und können sich an Rändern sammeln oder zusammenlagern. Solche Trocknungsartefakte sehen aus wie Aggregate, obwohl die Partikel in Lösung einzeln vorlagen.

Um das zu verringern, helfen verdünnte Proben, hydrophilisierte Kohlenstofffilme und kurze Kontaktzeiten. Salze und Puffer kristallisieren beim Trocknen aus und stören das Bild, deshalb werden Proben oft vorher in Wasser überführt.

Negativkontrastierung

Organische Partikel wie Liposomen, Viren oder Proteinkomplexe streuen Elektronen schwach. Bei der Negativkontrastierung wird die Probe mit einer Lösung eines Schwermetallsalzes behandelt, die die Umgebung der Partikel dunkel färbt. Die Partikel erscheinen hell vor dunklem Hintergrund. Die Methode ist schnell, kann aber weiche Strukturen beim Trocknen verformen.

Kryo-TEM

Bei der Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie wird ein dünner Flüssigkeitsfilm so schnell eingefroren, dass das Wasser nicht kristallisiert, sondern glasartig erstarrt. Die Partikel bleiben in nahezu natürlichem, hydratisiertem Zustand erhalten und werden bei sehr tiefen Temperaturen abgebildet. Für die Entwicklung der Kryo-Elektronenmikroskopie wurde 2017 der Nobelpreis für Chemie vergeben.

Für Liposomen, Lipid-Nanopartikel und andere weiche Nanostrukturen ist die Kryo-TEM die Methode der Wahl. Sie zeigt etwa, ob Liposomen eine oder mehrere Lipidschichten haben, wie dicht das Innere von Lipid-Nanopartikeln ist und ob Partikel ungewollt verschmolzen sind.

Mehr als nur Bilder: Analytik im TEM

Moderne Geräte kombinieren die Abbildung mit weiteren Verfahren:

Verfahren	Liefert	Typische Frage
Hochauflösende TEM (HRTEM)	Gitterebenen einzelner Kristalle	Ist der Partikel ein Einkristall oder verzwillingt?
Elektronenbeugung (SAED)	Beugungsmuster	Welche Kristallstruktur liegt vor?
Raster-TEM mit Dunkelfelddetektor (STEM-HAADF)	Kontrast nach Ordnungszahl	Wo sitzen schwere Atome, etwa in Kern-Schale-Partikeln?
Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX)	Elementverteilung	Woraus bestehen Kern und Schale?
Elektronenenergieverlustspektroskopie (EELS)	Elemente, Bindungszustände	Wie ist die chemische Umgebung an der Oberfläche?
Elektronentomografie	dreidimensionale Struktur	Welche Form hat der Partikel wirklich?

Größenverteilungen richtig auswerten

Eine einzelne schöne Aufnahme ist kein Messergebnis. Für eine belastbare Größenverteilung braucht es ein systematisches Vorgehen.

Checkliste für die Auswertung

1. Repräsentative Bilder: Aufnahmen aus mehreren zufällig gewählten Bereichen des Netzchens, nicht nur aus besonders schönen Stellen.
2. Kalibrierte Vergrößerung: Der Maßstab muss mit einem Referenzpräparat geprüft sein.
3. Ausreichende Zahl: In der Regel mehrere hundert Partikel, bei breiten Verteilungen mehr.
4. Klare Regeln: Festlegen, wie mit überlappenden, angeschnittenen oder aggregierten Partikeln umgegangen wird, und diese Regeln dokumentieren.
5. Geeignete Größenangabe: Bei Kugeln der flächengleiche Durchmesser, bei anderen Formen zusätzlich minimaler und maximaler Feret-Durchmesser oder das Seitenverhältnis.
6. Software mit Kontrolle: Automatische Bildanalyse spart Zeit, die Erkennung muss aber stichprobenartig geprüft werden, besonders bei schwachem Kontrast.
7. Statistik angeben: Mittelwert, Median, Standardabweichung oder Perzentile und die Zahl der ausgewerteten Partikel.

Die Norm ISO 21363 beschreibt Verfahren zur Bestimmung von Größen- und Formverteilungen mit der TEM.

Typische Fehlerquellen

• Auswahlverzerrung: Wer nur dort fotografiert, wo die Partikel gut aussehen, erhält eine geschönte Verteilung.
• Schwelle bei der Bildanalyse: Eine zu hohe oder zu niedrige Grauwertschwelle macht Partikel systematisch kleiner oder größer.
• Aggregate: Zusammenhängende Partikel werden von der Software leicht als ein großer Partikel gezählt.
• Kleine Partikel: Sehr kleine oder kontrastarme Partikel werden übersehen, die Verteilung verschiebt sich zu größeren Werten.
• Präparationsartefakte: Trocknung kann die Verteilung auf dem Netz entmischen, sodass große und kleine Partikel an unterschiedlichen Stellen liegen.

Ergebnis darstellen

Üblich ist ein Histogramm der gemessenen Durchmesser mit angegebener Klassenbreite, dazu die Zahl der ausgewerteten Partikel und ein bis zwei typische Aufnahmen mit Maßstabsbalken. Bei Partikeln, die keine Kugeln sind, empfiehlt sich zusätzlich eine Darstellung des Seitenverhältnisses. So können Leserinnen und Leser die Verteilung selbst beurteilen und mit eigenen Messungen vergleichen.

TEM im Zusammenspiel mit anderen Methoden

Die TEM liefert eine anzahlbasierte Verteilung des Kerns. Die dynamische Lichtstreuung liefert eine intensitätsgewichtete Verteilung des hydrodynamischen Durchmessers in Lösung. Beide Werte unterscheiden sich fast immer, und genau diese Differenz ist aufschlussreich: Ein großer Abstand kann auf eine dicke Hülle, auf Aggregation in Lösung oder auf einige wenige große Partikel hinweisen, die die DLS überbetont.

Für die Stabilität in Lösung liefert das Zetapotential zusätzliche Informationen, die das TEM nicht bieten kann. Für regulatorische Fragen, etwa ob ein Stoff unter die EU-Definition für Nanomaterial fällt, ist die TEM eine der wichtigsten Methoden, weil die Definition auf einer anzahlbasierten Größenverteilung beruht.

Stärken und Grenzen im Überblick

Stärken	Grenzen
direkte Abbildung einzelner Partikel	trockene Probe im Vakuum, außer bei Kryo-TEM
Auflösung bis unter einen Nanometer	nur kleiner Ausschnitt der Probe
Form, Kristallstruktur und Zusammensetzung	organische Hüllen kaum sichtbar
anzahlbasierte Verteilung	aufwendige Präparation und Auswertung
Kombination mit Element- und Strukturanalytik	teure Geräte, erfahrenes Personal nötig

Fazit

Die TEM ist unverzichtbar, wenn Größe und Form einzelner Nanopartikel bekannt sein müssen. Ihre Ergebnisse sind nur so gut wie Präparation und Auswertung: repräsentative Bilder, ausreichend viele Partikel und dokumentierte Regeln machen aus Aufnahmen eine Messung. Die Übersicht aller Messmethoden finden Sie auf der Seite Charakterisierung von Nanomaterialien.