ELISA einfach erklärt: Ablauf und Varianten

Ein ELISA ist ein Labortest, der ein bestimmtes Molekül, etwa ein Protein, ein Hormon oder einen Antikörper, mit Hilfe von Antikörpern einfängt und über eine Enzymreaktion als Farbsignal messbar macht. Die Abkürzung steht für Enzyme-linked Immunosorbent Assay. Die Probe wird in den Vertiefungen einer Kunststoffplatte nacheinander mit Antikörpern, Enzym und Substrat inkubiert, dazwischen wird gewaschen, am Ende misst ein Photometer die Farbe und eine Standardkurve liefert die Konzentration.

Das Grundprinzip in drei Sätzen

Antikörper erkennen ihr Zielmolekül, das Antigen, sehr spezifisch. Ein Enzym, das an einen der beteiligten Antikörper gekoppelt ist, setzt ein farbloses Substrat in einen Farbstoff um, und zwar umso mehr, je mehr Enzym in der Vertiefung gebunden ist. Weil ein einzelnes Enzymmolekül viele Substratmoleküle umsetzt, wird das Signal dabei stark verstärkt.

Die Methode wurde 1971 unabhängig voneinander von zwei Arbeitsgruppen in Schweden und den Niederlanden beschrieben. Sie ersetzte in vielen Bereichen den Radioimmunassay, der mit radioaktiven Markierungen arbeitete. Heute gehört der ELISA zum Standardrepertoire in Forschung, klinischer Diagnostik, Lebensmittelanalytik und Qualitätskontrolle.

Die Bausteine eines ELISA

• Mikrotiterplatte: meist 96 Vertiefungen aus Polystyrol, an dessen Oberfläche Proteine durch Adsorption haften.
• Fänger- und Nachweisantikörper: häufig monoklonale Antikörper, die jeweils eine bestimmte Stelle des Zielmoleküls erkennen.
• Enzym: am häufigsten Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalische Phosphatase (AP).
• Substrat: für HRP oft TMB (blaues Produkt, nach dem Abstoppen gelb, gemessen bei 450 nm), für AP oft pNPP (gelbes Produkt, gemessen bei 405 nm).
• Blockierlösung: zum Beispiel Albumin, Kasein oder Magermilchpulver, um freie Bindestellen der Platte abzudecken.
• Waschpuffer: meist phosphatgepufferte Salzlösung mit einem milden Detergens.

Ablauf eines Sandwich-ELISA Schritt für Schritt

Der Sandwich-ELISA ist das am häufigsten genutzte Format für die Messung von Proteinen. Ein typischer Ablauf sieht so aus:

1. Beschichten: Der Fängerantikörper wird in Puffer in die Vertiefungen gegeben und haftet über Nacht oder einige Stunden an der Plattenoberfläche.
2. Waschen und Blockieren: Ungebundener Antikörper wird entfernt, freie Kunststoffflächen werden mit Blockierlösung abgedeckt.
3. Probe und Standards: Proben und eine Verdünnungsreihe bekannter Konzentrationen werden aufgetragen. Das Zielmolekül bindet an den Fängerantikörper.
4. Waschen.
5. Nachweisantikörper: Ein zweiter Antikörper bindet an eine andere Stelle des Zielmoleküls. Er ist entweder direkt mit dem Enzym gekoppelt oder trägt Biotin.
6. Enzymkonjugat: Bei biotinylierten Nachweisantikörpern folgt Streptavidin, das mit HRP gekoppelt ist. Die starke Bindung zwischen Biotin und Streptavidin ist ein Klassiker der Biokonjugation.
7. Waschen.
8. Substrat: TMB wird zugegeben, in Vertiefungen mit gebundenem Enzym entsteht eine Blaufärbung.
9. Abstoppen: Verdünnte Säure beendet die Reaktion, die Farbe schlägt nach Gelb um.
10. Messen: Ein Plattenphotometer bestimmt die optische Dichte jeder Vertiefung.

Je mehr Zielmolekül in der Probe ist, desto mehr Nachweisantikörper und Enzym werden gebunden, desto intensiver die Farbe. Das Prinzip ist mit dem Sandwich-Format eines Lateral-Flow-Schnelltests verwandt, nur dass dort Nanopartikel statt eines Enzyms das Signal liefern.

Die vier Varianten im Vergleich

Wann welches Format?

Der indirekte ELISA ist die erste Wahl, wenn Antikörper in einer Probe gesucht werden, etwa um festzustellen, ob jemand gegen einen Erreger Antikörper gebildet hat. Der Sandwich-ELISA eignet sich für größere Antigene mit mindestens zwei Bindestellen und ist besonders spezifisch, weil zwei unabhängige Antikörper passen müssen. Der kompetitive ELISA ist nötig, wenn das Zielmolekül so klein ist, dass nicht zwei Antikörper gleichzeitig binden können. Hier gilt umgekehrt: Viel Zielmolekül bedeutet wenig Farbe.

Auswertung: die Standardkurve

Ein ELISA misst keine Konzentration, sondern eine Farbintensität. Um daraus Konzentrationen zu berechnen, wird auf jeder Platte eine Standardreihe mit bekannten Mengen des Zielmoleküls mitgeführt. Trägt man die optische Dichte gegen die Konzentration auf, ergibt sich typischerweise eine S-förmige Kurve: flach bei sehr niedrigen Werten, steil im mittleren Bereich, wieder flach bei Sättigung.

Für die Anpassung wird häufig ein Vier-Parameter-logistisches Modell (4PL) verwendet, das diese S-Form gut beschreibt. Lineare Anpassungen sind nur im mittleren Abschnitt sinnvoll. Wichtige Regeln für die Auswertung:

• Proben nur im gültigen Messbereich der Kurve auswerten. Liegt ein Wert darüber, wird die Probe verdünnt und erneut gemessen.
• Blindwert (Vertiefungen ohne Antigen) von allen Messwerten abziehen.
• Proben und Standards mindestens in Doppelbestimmung messen und die Abweichung zwischen den Wiederholungen prüfen.
• Verdünnungsfaktoren bei der Rückrechnung berücksichtigen.

Liegen Messwerte unterhalb des niedrigsten Standards, wird das Ergebnis als kleiner als die untere Bestimmungsgrenze angegeben und nicht aus der Kurve extrapoliert. Bei Vergleichen über mehrere Platten hinweg helfen Kontrollproben mit bekanntem Gehalt, die auf jeder Platte mitlaufen.

Typische Fehler und wie man sie erkennt

Kreuzreaktionen sind eine weitere Fehlerquelle: Ein Antikörper bindet auch an ähnliche Moleküle und täuscht höhere Konzentrationen vor. Deshalb wird jeder ELISA vor dem Routineeinsatz validiert, also auf Spezifität, Nachweisgrenze, Präzision, Richtigkeit und Linearität der Verdünnung geprüft.

Wie lange dauert ein ELISA?

Die reine Arbeitszeit ist überschaubar, die Wartezeiten summieren sich. Die Beschichtung der Platte läuft häufig über Nacht, alternativ einige Stunden bei Raumtemperatur oder 37 Grad. Blockieren, Probeninkubation, Nachweisantikörper und Enzymkonjugat brauchen jeweils zwischen einer halben und zwei Stunden, die Substratreaktion meist 15 bis 30 Minuten. Ein klassischer Sandwich-ELISA verteilt sich deshalb oft auf zwei Tage oder füllt einen Arbeitstag. Fertige Testkits mit vorbeschichteten Platten verkürzen den Ablauf auf wenige Stunden. Verbindlich sind immer die Zeiten im jeweiligen Protokoll, denn Inkubationszeit und Temperatur beeinflussen das Signal und müssen für alle Platten gleich bleiben.

Weiterentwicklungen

Das ELISA-Prinzip wurde vielfach weiterentwickelt. Statt eines Farbstoffs erzeugen Chemilumineszenz-Substrate Licht und erweitern den Messbereich. In automatisierten Laborgeräten ersetzen magnetische Partikel die Plattenoberfläche. Digitale Verfahren schließen einzelne Moleküle in winzige Kammern ein und zählen sie, was die Empfindlichkeit um Größenordnungen erhöhen kann. Nanopartikel spielen dabei eine wachsende Rolle, als Träger für Fängerantikörper, als Signalverstärker oder als Ersatz für Enzyme. Einen Überblick über solche Sensorprinzipien gibt die Seite Biosensoren und Schnelltests.

Zusammenfassung

Der ELISA verbindet die Spezifität von Antikörpern mit der Signalverstärkung durch ein Enzym. Je nach Fragestellung wird er direkt, indirekt, als Sandwich oder kompetitiv aufgebaut. Für verlässliche Ergebnisse zählen gute Antikörper, sorgfältiges Waschen, eine saubere Standardkurve und Kontrollen auf jeder Platte. Die immunologischen Grundlagen dazu erklärt die Seite Nanotechnologie und Immunologie.