CRISPR-Diagnostik: Die Genschere als Nachweistest

CRISPR-Diagnostik verwandelt die bekannte Genschere in einen Sensor. Statt Erbgut zu verändern, sucht ein Cas-Enzym in einer Probe nach einer bestimmten DNA- oder RNA-Sequenz, etwa eines Virus oder einer Mutation. Findet es sie, schaltet es in einen aktiven Zustand und zerschneidet zugegebene Reportermoleküle, was als Leuchten oder als Linie auf einem Teststreifen sichtbar wird. Die Methode ist seit etwa 2017 in der Forschung etabliert und steht in der Routine noch am Anfang.

Von der Genschere zum Sensor

CRISPR-Cas ist ursprünglich ein Abwehrsystem von Bakterien gegen Viren. Bakterien speichern Erbgutschnipsel früherer Angreifer und erzeugen daraus kurze Leit-RNAs. Diese führen ein Cas-Enzym zu passender fremder Erbsubstanz, die dann zerschnitten wird. 2012 zeigten Forschende, dass sich das Enzym Cas9 mit einer selbst entworfenen Leit-RNA auf nahezu jede DNA-Sequenz programmieren lässt. Dafür erhielten Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna 2020 den Nobelpreis für Chemie. Wie CRISPR in der Biotechnologie insgesamt eingesetzt wird, beschreibt die Themenseite Biotechnologie.

Für die Diagnostik sind andere Cas-Enzyme interessanter als Cas9. Cas12 und Cas13 haben eine Eigenschaft, die zunächst wie ein Nebeneffekt wirkte: Nachdem sie ihr Ziel erkannt haben, schneiden sie nicht nur dieses, sondern danach auch beliebige andere Nukleinsäuren in ihrer Umgebung. Diese unspezifische Aktivität heißt Kollateralspaltung oder trans-Spaltung, und sie ist der Kern der CRISPR-Diagnostik.

Das Prinzip in vier Schritten

1. Probe aufbereiten: Erbgut wird aus Abstrich, Speichel, Blut oder einer Umweltprobe freigesetzt.
2. Ziel vervielfältigen: Meist wird die gesuchte Sequenz zuerst mit einem isothermen Verfahren wie RPA oder LAMP vermehrt. Diese Methoden arbeiten bei konstanter Temperatur und brauchen keinen Thermocycler.
3. Erkennen: Das Cas-Enzym mit seiner Leit-RNA bindet die Zielsequenz und wird aktiviert.
4. Signal erzeugen: Das aktivierte Enzym zerschneidet viele Reportermoleküle. Ein einziges Erkennungsereignis setzt so eine Vielzahl von Schnitten in Gang, das Signal wird verstärkt.

Wie das Ergebnis ausgelesen wird

Fluoreszenz

Der Reporter ist ein kurzes Nukleinsäurestück mit einem Farbstoff an einem Ende und einem Löschmolekül am anderen. Solange er intakt ist, unterdrückt das Löschmolekül das Leuchten. Wird er zerschnitten, trennen sich beide und die Probe leuchtet unter Anregungslicht. Das Signal lässt sich mit einem Lesegerät messen, teils auch mit einer einfachen Lichtquelle.

Teststreifen

Für den Einsatz ohne Gerät wird der Reporter an beiden Enden mit Markern versehen, etwa einem Farbstoffmolekül und Biotin. Auf einem Teststreifen fangen Antikörper und Streptavidin diese Marker an festgelegten Linien ab, Goldnanopartikel machen die Linien sichtbar. Ob der Reporter intakt oder zerschnitten ist, verschiebt das Signal von einer Linie zur anderen. Wie Teststreifen grundsätzlich aufgebaut sind und welche Rolle Gold dabei spielt, erklärt der Artikel zum Lateral-Flow-Schnelltest.

Wichtig für das Ablesen: Bei manchen CRISPR-Streifen ist die Logik anders als bei einem gewohnten Antigentest, und auch ein schwaches Signal kann bedeutsam sein. Wie ein bestimmter Test zu deuten ist, steht nur in seiner Gebrauchsanweisung.

Die Leit-RNA entscheidet über die Treffsicherheit

Das eigentliche Erkennungselement eines CRISPR-Tests ist die Leit-RNA, im Englischen guide RNA oder crRNA. Sie enthält einen Abschnitt von etwa 20 Bausteinen, der genau zur gesuchten Sequenz passt. Beim Entwurf achten Forschende auf mehrere Punkte:

• Einzigartigkeit: Die Zielsequenz soll im gesuchten Erreger vorkommen, aber nicht in verwandten Arten oder im menschlichen Erbgut der Probe.
• Konservierung: Bei Viren, die sich schnell verändern, wird ein Abschnitt gewählt, der zwischen Varianten möglichst gleich bleibt, sofern nicht gerade eine Variante unterschieden werden soll.
• Position von Fehlpaarungen: Ein einzelner abweichender Baustein wirkt sich je nach Position unterschiedlich stark aus. Das lässt sich gezielt nutzen, um Mutationen zu erkennen.
• Zusammenspiel mit der Vorvervielfältigung: Primer für RPA oder LAMP und die Leit-RNA müssen aufeinander abgestimmt sein.

Weil eine neue Leit-RNA chemisch einfach herzustellen ist, gilt die Methode als besonders anpassungsfähig. Ob ein neues Design zuverlässig funktioniert, muss aber jedes Mal mit echten Proben geprüft werden.

Anwendungen außerhalb der Humanmedizin

CRISPR-Diagnostik wird nicht nur für Patientenproben erforscht. In der Landwirtschaft geht es um Pflanzenviren und Pilzerreger, die früh im Feld erkannt werden sollen. In der Tiermedizin werden Tests auf Tierseuchen untersucht. In der Lebensmittelkontrolle könnten CRISPR-Tests Tierarten in Fleischprodukten oder bestimmte Erreger nachweisen, wie es der Artikel zu Biosensoren in der Lebensmittelsicherheit für andere Sensortypen beschreibt. Auch in der Umweltüberwachung, etwa bei Abwasseranalysen, werden solche Verfahren erprobt.

Stärken der Methode

• Programmierbarkeit: Für ein neues Ziel muss vor allem eine neue Leit-RNA entworfen werden. Das macht die Anpassung an neue Erregervarianten vergleichsweise schnell.
• Spezifität: Mit geeignetem Design lassen sich Sequenzen unterscheiden, die sich nur in einem einzigen Baustein unterscheiden, etwa Resistenzmutationen.
• Wenig Gerät: Isotherme Vervielfältigung und Teststreifen-Auslesung kommen ohne Thermocycler aus. Das macht die Methode interessant für die Point-of-Care-Diagnostik.
• Multiplex: Durch Kombination verschiedener Cas-Enzyme und Reporter lassen sich in der Forschung mehrere Ziele parallel erfassen.

Grenzen und offene Fragen

• Mehrere Schritte: Viele Protokolle bestehen aus Probenaufbereitung, Vervielfältigung und Cas-Reaktion. Jeder offene Schritt birgt das Risiko von Verunreinigungen und Fehlern.
• Kontamination: Vervielfältigte Erbsubstanz kann die Umgebung verunreinigen und falsch positive Ergebnisse erzeugen. Geschlossene Ein-Topf-Formate sollen das verhindern.
• Quantifizierung: CRISPR-Tests liefern meist ein Ja oder Nein. Eine Mengenangabe wie bei der quantitativen PCR ist schwieriger.
• Stabilität und Kosten: Enzyme und RNA müssen gekühlt oder gefriergetrocknet gelagert werden. Für breite Anwendung müssen Herstellung und Haltbarkeit noch zuverlässiger werden.
• Validierung: Wie jedes In-vitro-Diagnostikum muss ein CRISPR-Test in klinischen Studien zeigen, dass er zuverlässig ist. Für den EU-Markt gelten die Anforderungen der IVDR.

Wo steht die Entwicklung?

Während der Covid-19-Pandemie wurden CRISPR-basierte Tests auf SARS-CoV-2 entwickelt, und in den USA erhielten 2020 erste solche Tests eine Notfallzulassung für den Laboreinsatz. In der Breite der medizinischen Routine haben sie sich bislang nicht durchgesetzt, dort dominieren weiterhin PCR und Antigentests. Aktive Forschungsfelder sind Tests auf Antibiotikaresistenzen, Krebsmutationen in Blutproben, Erreger von Tropenkrankheiten, Pflanzen- und Tierkrankheiten sowie Lebensmittelkontrolle. Hinzu kommen Varianten, die ohne Vorvervielfältigung auskommen sollen, etwa durch gekoppelte Enzymreaktionen oder empfindliche elektrochemische Auslesung.

CRISPR-Diagnostik und PCR im Vergleich

Fazit

CRISPR-Diagnostik verbindet die Programmierbarkeit der Genschere mit einer eingebauten Signalverstärkung durch Kollateralspaltung. Zusammen mit isothermer Vervielfältigung und Teststreifen aus der Nanobiotechnologie entsteht ein Nachweis, der im Prinzip ohne großes Labor auskommt. Bis solche Tests breit verfügbar sind, müssen Bedienung, Stabilität und klinische Validierung weiter wachsen. Einen Überblick über alle Sensorprinzipien bietet die Seite Biosensoren.